Question

诺如病毒是一种单链 RNA  病毒，可引起流行性急性肠胃炎的重要病原体。诺如病毒衣壳 P 蛋白上含有抗原位点和受体识别位点，在体外可单独表达，被用于疫苗的免疫实验研究。

（1）人体感染诺如病毒后，会引发_____免疫，在康复者血清中能够检测到_____（物质）。有研究表明感染后第 180 天记忆 B 细胞仍具有持久性，说明这些细胞对机体具有_____作用。

（2）研究人员希望借 P 蛋白治疗由β蛋白沉积导致的阿尔茨海默症，选取β蛋白作为免疫原，利用诺如病毒 P 颗粒作为疫苗载体，研究其免疫原性。研究人员将β蛋白基因插入 P 蛋白基因的恰当位置，制备了重组 P 蛋白基因 P-β（1780bp）后，采用双酶切方法，通过 NdeⅠ和XhoⅠ酶和pET 载体质粒（5230bp）构建重组质粒 pET-P-β，如图 1。对照组应选用_____________。

①诺如病毒 RNA②P 蛋白基因与 pET 载体质粒构建的重组质粒 pET-P ③pET 载体质粒

（3）为了鉴定重组质粒 pET-P-β是否构建成功，NdeⅠ和 XhoⅠ酶分别对重组质粒 pET-P-β 和 pET 载体质粒进行酶切，然后酶切片段和重组 P 蛋白基因进行电泳，重组 P 蛋白基因的电泳结果出现一条带，位置是 1780bp，请将你判断 pET 载体质粒的电泳结果位置是_____bp， 重组质粒 pET-P-β的电泳结果出现_____条带，位置是_____。

（4）想要获得目的蛋白，需要将构建的重组质粒 pET-P-β、pET-P 和 pET 分别转入用_____ 处理的成为感受态的大肠杆菌细胞，培养处理后提取蛋白质。过程如下：

若干健康小鼠随机分为 3 组，将提取的蛋白质分别溶于 PBS 缓冲液，对小鼠进行皮下免疫， 并对 4 次免疫后的血清进行不同梯度稀释，用_____（β蛋白/P 蛋白）作为抗原，通过免疫法检测重组 P-β蛋白的免疫原性。如图 2 所示，请据图描述出能够表明 P-β蛋白可以在小鼠体内引起免疫反应，具有特异的免疫原性的实验结果_________

Answer

特异性（体液） 抗体 潜在的长期保护（预防再次感染） ②③ 5230 两 1780bp和5230bp Ca2+（CaCl2） β蛋白 在不同稀释度条件下，P-β蛋白组的吸光度值均明显高于PBS组和P蛋白组，PBS组和P蛋白组区别较小

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）人体感染诺如病毒后，机体受到抗原的刺激会引发特异性免疫，在康复患者的血清中产生特异性抗体。记忆细胞能相对持久的识别相同的抗原，避免相同抗原再次入侵对机体的损害，说明记忆细胞对机体具有潜在的长期保护作用。

（2）采用双酶切法获得了重组质粒pET-P-β，为了研究β蛋白的免疫原性，依据单一变量的原则，对照组应该是P蛋白基因与pET载体质粒构建的重组质粒pET-P和pET载体质粒，即②③。

（3）根据题干信息，重组P蛋白基因P-β为1780bp，pET载体质粒为5230bp；用NdeⅠ和XhoⅠ酶酶切重组质粒pET-P-β能获得P-β和pET两个片段；因此p-β酶切电泳后出现一条带，位置是1780bp，PET酶切电泳后出现一条带，位置是5230bp、PETp-β酶切后出现两条带，位置分别是1780bp和5230bp。

（4）将基因表达载体导入大肠杆菌之前，要将大肠杆菌放入一定浓度的CaCl2溶液中处理，使之成为感受态的细胞。本题欲研究β蛋白的免疫原性，因此免疫后的血清进行不同梯度稀释后，用β蛋白作为抗原，通过免疫法检测重组P-β蛋白的免疫原性。据图2结果显示，在不同稀释度条件下，P-β蛋白组的吸光度值均明显高于PBS组和P蛋白组，PBS组和P蛋白组区别较小。