Question

科研人员利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图1所示，①-④为操作步骤，载体上BamHⅠ、BglⅡ、EcoRI酶切位点唯一，识别序列和切割位点见表1。

限制酶	识别序列和切割位点
Bam HI	—G' GATCC—
BglⅡ	—A' GATCT—
EcoRI	—G'AATTC—

（1）步骤①为__________，其目的是__________ 。

（2）若目的基因用BamH I和Bgl Ⅱ剪切，质粒用BamH I剪切，剪切后的目的基因和 质粒能连接在一起，原因是__________。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用_____酶对两种重组质粒进行剪切，通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如图2所示，图中_____(样品1/样品2)为所需基因表达载体。

（3）步骤②用__________处理农杆菌后获得感受态细胞，以便将重组质粒导入。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加__________以便筛选岀含目的基因的甘蓝植株。若要检测甘蓝是否具有抗除草剂的性状，需要在个体水平通过________进行检测。

Answer

基因表达载体的构建 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用 BamH I和BglⅡ 切割DNA后产生相同的黏性末端
BamH I和EcoR I 样品2 Ca2+ 潮霉素 喷洒适宜浓度的除草剂

【解析】

分析题图可知，①为基因表达载体的构建，②为将重组质粒导入农杆菌，③为农杆菌侵染愈伤组织，④为植物组织培养。

（1）步骤①为基因表达载体的构建；目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传给下一代，同时是目的基因能够表达和发挥作用；

（2）据图表可知，Bam HI切割得到的黏性末端为-GATC，Bgl Ⅱ切割得到的黏性末端为-GATC，其黏性末端相同，故剪切后的目的基因能与质粒连接在一起；重组质粒形成后，在重组质粒上，质粒上的切割位点会有EcoRI-Bam HI-Bgl Ⅱ和EcoRI-Bgl Ⅱ-Bam HI两种顺序，而目的基因的编码顺序是从Bam HI到Bgl Ⅱ，故要用EcoRI和Bam HI将EcoRI-Bgl Ⅱ-Bam HI这种反向连接的重组质粒剪切去除；正向连接的重组质粒会被切去20kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去45kb长度的片段，电泳凝胶中，DNA分子量越大，在凝胶中收到的阻力越大，迁移距离越短，说明样品2是所需的基因表达载体。

（3）步骤②用Ca2+处理农杆菌获得感受态细胞；质粒中含有潮霉素抗性基因，故在步骤④的培养基中需要添加潮霉素以筛选出含目的基因的甘蓝植株；若要检测甘蓝是否具有抗除草剂的性状，需要在个体水平通过喷洒适宜浓度的除草剂进行检测。