Question

鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
 

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是____。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和___________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是_________。

A．Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点

B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有___________，步骤③中需先用______处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是___________。

（4）用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数（植物受病毒侵染的严重程度）为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79。说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有__________。

Answer

鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC AC 复制原点 Ca2+ 逆转录 鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录 22 实验得到的干扰素表达量较低，未能很好启动机体产生抗性；或：病毒接种量过大，相对来说干扰素诱导调控作用滞后；或：植物体内缺乏干扰素受体，导致外源基因表达的干扰素诱导或调控作用减弱

【解析】试题分析：分析图解，图中过程①表示获取目的基因，过程②表示基因表达载体的构建，过程③表示将重组质粒导入农杆菌，过程④表示目的基因的检测和鉴定。

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点，A正确；目的基因编码蛋白质的序列中，不能有限制酶的切割位点，B错误；酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同，否则会自我环化，C正确；酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列应该不同，否则会自我连接，D错误。

（2）基因表达载体必需具备的成分有目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点，图中还缺复制原点；微生物细胞作为受体细胞时，需要钙离子处理使其变为感受态细胞，因此过程③中需先用Ca2+（或CaCl2）处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）提取的愈伤组织细胞的RNA通过逆转录过程得到DNA；最终未能检测出干扰素基因，可能是因为鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录。

（4）据图分析，接种后第19天对照组植株进入病情指数为100的平台期，而转基因植株在第22天才进入平台期，且此时的病情指数为79，说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能是因为实验得到的干扰素表达量较低，未能很好启动机体产生抗性（或病毒接种量过大，相对来说干扰素诱导调控作用滞后；或植物体内缺乏干扰素受体，导致外源基因表达的干扰素诱导或调控作用减弱）。