Question

某兴趣小组对受污染的河流水体进行了大肠杆菌数目的测定。请回答问题：

（1）测定大肠杆菌活菌数目时，需制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，该培养基中为细菌提供氮源的物质是______________。培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右才能用来倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度？_____________。等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置的原因是____________________。为了鉴别大肠杆菌菌落，可向培养基中加入伊红美蓝作为指示剂，大肠杆菌的菌落呈现__________。

（2）为了便于统计污染严重的水体中活菌的数目，需将水样进行适当稀释，例如取水样2mL，加入无菌水________mL制备稀释倍数为10¹的稀释液，并照此依次制备更高倍数的稀释液。每个稀释倍数的菌液取10mL进行过滤，然后将滤膜放置在培养基上。为了防止杂菌污染，稀释、过滤和旋转滤膜等操作都应该在__________进行。

（3）将放有滤膜的平板置于适宜条件下培养，每隔12h统计一次菌落数目，应选取菌落数目____________时的记录作为结果。如果经过培养后稀释倍数为10²的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48，那么每升河水中约含大肠杆菌_______个。用这种方法测定的菌落数量往往比实际活菌数量更_______，这是因为_____________。

（4）除了上述活菌计数法外，显微镜直接计数也是测定细菌数量的常用方法。利用血细胞计数板（2mm×2mm）、滴管、试管、显微镜等仪器进行研究，从试管中吸出培养液进行计数之前，应将_________________；采用抽样检测的方法，先_______________计数室上，再_______________________，让培养液自行渗入计数室（厚度为0.1mm）；需稍等片刻，待____________________时，再将血细胞计数板放在显微镜下观察计数。已知计数板每小格为0.1mm×0.1mm，经随机检测，五个小方格内细菌平均数为8.2个，则细菌密度_________个/L。

Answer

牛肉膏和蛋白胨 手背触摸不烫手 防皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发 黑色 18 酒精灯火焰附近 稳定 4.5×105 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落 试管轻轻振荡几次 将盖玻片放在 将吸取的培养液滴于盖玻片边缘 细胞全部沉降到计数室底部 8.2×109

【解析】试题分析：本题主要考查牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备，制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般步骤是：计算、称量、溶化、调pH、灭菌、倒平板。对大肠杆菌用稀释平板进行计数，计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，再利用计算公式：1毫升（克）样品中的菌株数=（C÷V）×M，算出大肠杆菌的个数。

（1）用牛肉膏蛋白胨固体培养基培养细菌时，培养基中的牛肉膏和蛋白胨能为细菌提供氮源。需要用手触摸盛有培养基的锥形瓶刚刚不烫手，此时培养基已冷却到50℃左右，可以进行倒平板操作。等待平板冷却凝固后需要倒置，防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在添加有伊红美蓝的培养基中，大肠杆菌的菌落呈现深黑色。

（2）用稀释涂布平板法进行对微生物计数时，当样品的稀释度足够高时，培养基表面的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌，若将水样稀释102倍，可取水样1mL加入到99mL的无菌水中进行稀释；为了防止杂菌污染，整个操作过程应进行无菌操作，所以在稀释、过滤和旋转滤膜等操作时都应该在酒精灯火焰附近进行。（3）统计培养的菌落数目时应选取菌落数目稳定时的记录作为结果，如果经过培养后稀释倍数为102的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48，则平板上平均菌落数=（43+47+42+48）÷4=45个，每毫河水中约含大肠杆菌数=（C÷V）×M=（45÷0.1）×102=4.5×104个，每升河水中约含大肠杆菌数=4.5×104×103=4.5×107个；用稀释涂布平板法测定的细菌数量比实际活菌数量要少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落。

（4）从试管中吸出培养液进行计数之前，应将试管轻轻振荡几次，采用抽样检测的方法，先将盖玻片放在计数室上，再将吸取的培养液滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入计数室，需稍等片刻，待细胞全部沉降到计数室底部时，再将血细胞计数板放在显微镜下观察计数。细菌密度=8.2×100×104×103=8.2×109个。