Question

Bar基因存在于青麻、黑麦草等生物体内，其编码的酶可使除草剂草丁膦失去毒害作用。培育转Bar基因大豆，对于控制豆田杂草有重要意义。为了把Bar基因导人大豆细胞，需将Bar基因插入pUcl8质粒中构建中间表达载体，然后与Ti质粒重组为重组表达载体系统。如图为pUcl8质粒的结构示意图，回答下列问题：

（1）不能利用黑麦草与大豆进行有性杂交的方法让大豆获得Bar基因，原因是______

（2）构建中间表达载体时，为了便于筛选出含有Bar基因的重组质粒，需将Br基因插入到pUcl8质粒的______中形成重组质粒并导入大肠杆菌，然后在添加______的培养基上培养大肠杆菌，菌落呈白色的即为含中间表达载体的大肠杆菌。

（3）中间表达载体需插入到Ti质粒的______中才能将Bar基因整合到植物细胞的染色体DNA上，原因是______。

（4）可通过______法直接将重组表达载体导入大豆细胞的原生质体。导入Bar基因的原生质体需______，经脱分化形成______，再进一步分化才能获得转Bar基因大豆植株。

Answer

黑麦草与大豆之间存在生殖隔离 lacZ 氨苄青霉素和Xgal T-DNA T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上 显微注射 再生出细胞壁 愈伤组织

【解析】

基因工程技术的基本步骤： 
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）由于黑麦草与大豆之间存在生殖隔离，因此不能利用黑麦草与大豆进行有性杂交的方法让大豆获得Bar基因。

（2）根据图中信息可知，lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶可以将培养基中的Xgal水解，使菌落呈蓝色，否则菌落呈白色。因此，构建中间表达载体时，为了便于筛选出含有Bar基因的重组质粒，需将Br基因插入到pUcl8质粒的lacZ中形成重组质粒并导入大肠杆菌，然后在添加氨苄青霉素和Xgal的培养基上培养大肠杆菌，菌落呈白色的即为含中间表达载体的大肠杆菌。

（3）Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。

（4）可通过显微注射法直接将重组表达载体导入大豆细胞的原生质体。导入Bar基因的原生质体需再生出细胞壁，经脱分化形成愈伤组织，再进一步分化才能获得转Bar基因大豆植株。