Question

测定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红美蓝的培养基(EMB 培养基)上培养→统计菌落数目。流程示意图如下图所示。其中，指示剂伊红美蓝可使大肠杆菌菌落呈现紫黑色。请据图回答问题：

（1）过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，均需要进行灭菌处理，与过滤有关的操作都要在超净台上酒精灯火陷旁进行。待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为：在无菌条件下用______冲洗滤杯，并再次_______。

（2）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的______操作。从物理状态角度分析，EMB 培养基属于_____培养基，为检测培养基灭菌是否彻底，对于固体培养基应采用的检测方法是________________。

（3）某生物兴趣小组的某同学尝试按照上述方法进行测定，无菌操作下将 10mL待测水样加入到 90mL无菌水中，稀释后的菌液通过滤膜法测得 EMB 培养基上的菌落数平均为84，紫黑色菌落数平均为21，则推测1L待测水样中的大肠杆菌数目为____。

（4）在配制尿素培养基的过程中，由于尿素具有______特性，导致其无法使用高压蒸汽灭菌法灭菌，通常通过选用合适_____的滤膜代替G₆玻璃砂漏斗，也可达到去除尿素溶液中杂菌的目的。培养后的菌种通常暂时保存在4度的冰箱中，是因为此温度下菌既停止生长，又短时间内不会死亡。

Answer

无菌水 过滤 接种 固体 将未接种的培养基在恒温箱中培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生 2100 加热会分解 孔径

【解析】

1、血细胞计数板法：用计数板计数，缺点是不能区分死菌和活菌。

2、稀释涂布平板法：①常用来统计样品中活菌的数目；②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低；③样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目，通常选用菌落数在30~300、适用于计数的平板进行计数，菌落太少或太多都会使计数准确性变差。

3、滤膜法：当样品中菌数很低时，可将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过滤膜过滤，通过培养观察形成的菌落敫来推算样品中的活菌数。例如，测定饮用水中大肠杆菌的数目：将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆

菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数目，此法统计的是样品中活菌的数目。

（1）过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，这些实验仪器都需要经过灭菌处理，与过滤有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌的污染。待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，此时可以在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上。

（2）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，属于微生物培养中的接种操作。从物理状态角度分析，EMB培养基中含有琼脂，故属于固体培养基。为检测培养基灭菌是否彻底，将未接种的培养基在恒温箱中培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生，如果有菌落产生，则灭菌不彻底，培养基配制不合格。

（3）无菌操作下将90ml无菌水加入到10ml待测水样中，这样就将待测水样稀释了10倍；根据大肠杆菌鉴定的原理可知，黑色菌落为大肠杆菌，因此1升待测水样中的大肠杆菌数目=21×（1000÷10）=2100个。

（4）在配制尿素培养基的过程中，由于尿素具有加热分解的特性，导致其无法使用高压蒸汽灭菌法灭菌，通常通过选用合适孔径的滤膜代替G6玻璃砂漏斗，也可达到去除尿素溶液中杂菌的目的。