Question

研究人员利用小鼠的单倍体ES细胞(只有一个染色体组)，成功培育出转基因小鼠。其主要技术流程如图所示，请分析回答下列问题：

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表四种限制酶。箭头指向的位置为限制酶的切割位置：Amp^r是氨芐青霉素抗性基因，Neo^r是G418抗性基因。

（1）利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物以外，还应含有________；引物应选用下图中的________(填图中标号)。

（2）在基因工程操作步骤中，过程①②称为________。已知氨芐青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo^r的小鼠细胞。结合上图推测，过程①选用的2种限制酶是________(选填图中的编号)，③处的培养液应添加________(填“氨芐青霉素”或“G418”)

（3）细胞乙与________类似，图中桑椹胚需通过________技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行________处理。

Answer

Taq酶(或耐高温的DNA聚合酶) A和D 基因表达载体的构建 Ⅰ和Ⅱ G418 受精卵 胚胎移植 同期发情

【解析】

1、PCR反应的条件：模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物、耐高温的DNA聚合酶，其中，dNTP的作用是合成DNA的原料、提供能量。

2、基因工程的操作步骤为：

提取目的基因、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。

（1）根据分析可知，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物以外，还应含有耐高温的DNA聚合酶。为了扩增目的基因的片段，根据图示可知需要在引物A和D作用下以目的基因的两条链为模板合成子代目的基因。

（2）由图可知，过程①②是将目的基因和运载体连接形成重组质粒，即基因表达载体的构建过程。重组质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，其作用是有利于筛选出含有目的基因的细胞。根据题意可知，氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo′的小鼠细胞，因此应选择Neo′作为标记基因，即质粒上Neo′不能用限制酶切割，则过程①应选用Ⅰ和Ⅱ两种限制酶，图中③处的培养液应添加G418以便于起到筛选的作用。

（3）处理形成的细胞乙与受精卵类似，应用早期胚胎培养技术可以使其发育成桑椹胚。再将桑椹胚通过胚胎移植技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行同期发情处理，以保证供体与受体处于相同或相近的生理状态。