Question

某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲）作目的基因，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：

（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________。使用这两种酶进行酶切是为了保证_______________的完整性，启动子能与_______特异性结合驱动转录开始。

（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和_________过程。

（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_____________移入牛的____________中、体外培养、胚胎移植等。

（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。

Answer

E1和E4 甲 RNA聚合酶 转录 翻译 细胞核 去核卵母细胞 核DNA

【解析】

目的基因的获取方法：基因文库获取，PCR，人工合成。

基因工程常用的工具：限制酶、DNA连接酶、运载体。

（1）甲是L1-GFP融合基因，需要插入到质粒中启动子和终止子之间且不能破坏自身的完整性，由图可知，应该选择E1和E4进行切割，启动子是RNA聚合酶结合的位点，启动转录。

（2）荧光蛋白基因表达才会出现绿色荧光，故若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了基因表达过程，即完成了转录和翻译过程。

（3）要获得含荧光的牛，应该通过核移植技术把能够产生绿色荧光的细胞核移入去核的卵母细胞中，获得重组细胞，再经过早期胚胎培养及胚胎移植，即可获得含有甲的牛。

（4）由于基因的选择性表达，同一基因在不同细胞的表达情况不同，要检测不同细胞中是否含目的基因，不能选择RNA进行鉴定，而应该获取DNA进行检测，另外PCR的模板是DNA不是RNA。