Question

如图1为某种常用质粒的序列图，Lac Z基因编码的酶能使无色的X﹣gal变为蓝色，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因。图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列。请回答下列问题：

（1）若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有________________________，构建重组质粒时需要的工具酶有________________，对获取的目的基因可用PCR技术对其扩增。

（2）实验小组用BamH I和Bgl II两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了____________________________。没有导入任何外源DNA的大肠杆菌_________（填“能”或 “不能”）在该培养基上生存。

（3）若质粒和目的基因用BamH I和Bgl II两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，然后再用BamH I和EcoR I切割成功连接后的重组质粒，可获得长度不同的_______种DNA片段。

Answer

X-gal、氨苄青霉素 限制酶、DNA连接酶 未导入目的基因的空质粒 不能 4

【解析】

分析题图：质粒中，抗氨苄青霉素抗性基因（Amp'）和LacZ基因都属于标记基因，含有目的基因的外源DNA分子上存在BamHⅠ和BlgⅡ两种酶的酶切位点，质粒上存在BamHⅠ和EcoRⅠ两种酶的酶切位点。一般为了防止目的基因和质粒反向连接，用两种限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒。

（1）由于Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Amp为氨苄青霉素抗性基因，所以若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有X-gal和氨苄青霉素。构建基因表达载体时，首先要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA和运载体，其次用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA。

（2）构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，由于Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入的是不含目的基因的空白质粒。若大肠杆菌菌落显白色，说明Lac Z基因被破坏，不能编码相应的酶，所以导入的是重组质粒。没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不含氨苄青霉素抗性基因，所以不能在该培养基上生存。

（3）BamH I和Bgl II两种限制酶切割形成的黏性末端相同，可在DNA连接酶的作用下连接起来。若质粒和目的基因用BamH I和Bgl II两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，可能会发生正向连接，也可能会发生反向连接。用BamH I和EcoR I切割成功连接后的重组质粒，若正向连接，切割后会得到两种长度不同的DNA片段，若反向连接，切割后会得到另外两种长度不同的DNA片段，因此，用BamH I和EcoR I切割成功连接后的重组质粒，可获得长度不同的4种DNA片段。