Question

为研究肝癌致病机理，科研工作者利用下图所示的差异杂交法和基因工程获取相关癌基因以作进一步研究。请据图回答问题：

（1）图 1 中，A 过程需要用___________ 酶，D 过程需要回收___________ （填“未杂交”或“杂交分子”）的含 ³²P 的 cDNA 单链，继而通过人工合成，获得___________， 并用其构建基因文库。

（2）分子生物学检测是基因工程成功与否的重要一环，其中检测目的基因是否发挥功能作用的第一 步是检测_________________________ ，若检测目的基因是否成功表达，则需用_______________ 方 法，该方法的原理是_____________________。

（3）上图 2 为改造后的目的基因。图 3 为两种质粒，其中 Ampr 为氨苄青霉素抗性基因，Tetr 为四环素抗性基因，lacZ 为蓝色显色基因，其表达产物可使底物 X-Gal 呈蓝色。EcoRⅠ（0.7Kb）、NotⅠ（1.2Kb）等为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离（1kb=1000 个碱基对）。

①图 3 中能作为载体的最理想的质粒是___________（填“X”或“Y”），用选定的质粒与图 2 的目的基因构建基因表达载体时，应选用的限制酶是___________。

②若用 EcoRⅠ完全酶切上述①中获得的重组质粒，并进行电泳观察，可出现四种长度不同的片段，其长度分别为 1.7kb、5.3kb、______________________。

Answer

逆转录酶 未杂交 双链cDNA 目的基因是否转录出mRNA 抗原-抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 X NotⅠ 3.1kb和3.9kb

【解析】

1、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）据图可知图1为构建基因文库的过程，其中需要单链mRNA通过A过程形成杂交双链分子，需要逆转录酶，D过程需要回收未杂交的含 32P 的 cDNA 单链，继而通过人工合成，获得双链cDNA，并用其构建基因文库。

（2）其中检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是检测目的基因是否转录出mRNA ，若检测目的基因是否成功表达（是否合成相关蛋白质），则需用抗原-抗体杂交方法，该方法的原理是抗原与抗体的特异性结合。

（3）质粒X既有四环素抗性基因Tetr ，蓝色显色基因lacZ ，便于对目的基因进行监测和筛选。因此能做为载体的最理想的质粒是X，NotⅠ的切割位点位于目的基因两侧，不会破坏目的基因，而EcoRⅠ的切割位点位于基因中间，会破坏目的基因，因此用选定的质粒与图 2 的目的基因构建基因表达载体时，应选用的限制酶是NotⅠ。若用 EcoRⅠ完全酶切上述①中获得的重组质粒，并进行电泳观察，可出现四种长度不同的片段，分析重组质粒，合并重复长度可知其长度分别为 1.7kb、5.3kb、3.1kb和3.9kb。