Question

马铃薯是表达外源蛋白的理想受体材料。某科研小组通过农杆菌转化法获得高产重组人血清白蛋白（rHSA)的转基因马铃薯，下图是该小组构建的基因表达载体中T-DNA示意图。请回答：

（1）天然农杆菌Ti质粒的T-DNA上具有tms和tmr基因（分别控制合成植物生长素和细胞分裂素），在人工改造质粒时应使用________切除这两个基因，以防止____________________。

（2）构建基因表达载体时，在rHSA基因两端分别加上限制酶KpnⅠ和SalⅠ的识别序列（两种酶切割产生不同的黏性末端)，从基因表达角度分析其目的是____________。科研小组PCR扩增rHSA基因时，其中一种引物碱基序列为：5＇-CGGGGTACCGCCACCATGGATGCACACAAG-3＇，该序列含有KpnⅠ识别序列和增强表达的序列5＇-GCCACC-3＇，则限制酶KpnⅠ的识别序列是_______________。

（3）将基因表达载体转入处于___________的农杆菌细胞中。用农杆菌转化液与马铃薯愈伤组织共培养一段时间后，为了得到已转化且不含农杆菌的愈伤组织，将感染后的愈伤组织转移至含有潮霉素和羧苄青霉素的培养基中培养，加潮霉素的目的是_______________，加羧苄青霉素的目的是____________。

Answer

限制酶 tms和tmr基因的表达产物影响受体植物内源激素的含量 rHSA基因能正向接入其启动子与终止子之间，保证rHSA基因能准确表达 或 5’-GGTACC-3’ 感受态 筛选出含潮霉素抗性基因的愈伤组织 除去含有潮霉素抗性基因的农杆菌

【解析】试题分析：本题结合转基因马铃薯的形成过程，考查基因工程的相关知识，意在考查学生分析题图获取有效信息的能力，以及理解所学知识要点，把握知识间联系的能力。学生可根据题图和题干的提示、要求，梳理相关知识点，对各小题进行分析作答，同时需要学生掌握基因工程的原理、操作步骤及其一些细节问题。

（1）由于天然农杆菌Ti质粒的T-DNA上具有tms和tmr基因（分别控制合成植物生长素和细胞分裂素），这两种基因表达可使植物合成植物生长素和细胞分裂素，进而影响了植物体内内源激素的含量，因此需要用限制性核酸内切酶切除tms和tmr基因。

（2）据图可知，加上的两种限制酶的识别序列在启动子与终止子之间，因此加上两种限制酶的识别序列后rHSA基因能正向接入其启动子与终止子之间，保证rHSA基因能准确表达。由于引物系列中含有KpnⅠ识别序列和增强表达的序列，KpnⅠ识别序列应该在增强表达序列5＇-GCCACC-3＇之前，即5’-GGTACC-3’。

（3）将将基因表达载体导入农杆菌时，首先必须用Ca2+处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态，以便于导入基因表达载体。将感染后的愈伤组织转移至含有潮霉素和羧苄青霉素的培养基中培养，加潮霉素的目的是筛选出含潮霉素抗性基因的愈伤组织，由于筛选的是愈伤组织，需要把含有潮霉素抗性基因的农杆菌除去，因此加入羧苄青霉素的目的是除去含有潮霉素抗性基因的农杆菌。