Question

将PVY病毒外壳蛋白基因（PVY-CP）导入马铃薯，并使之表达即可获得抗PVY病毒马铃薯。图示是获得抗病毒马铃薯的部分操作，PVY-CP可以从质粒pBBZY中获取；质粒pMON316是选用的运载体，其中NPTⅡ基因是卡那霉素抗性基因，另已知部分限制酶识别序列和切割位点：

BamHⅠ	HindⅢ	BglⅡ	ClaⅠ	SmaⅠ	KpnⅠ
G^↓GATCC CCTAG↑G	A^↓AGCTT TTCGA↑A	A^↓GATCT TCTAG↑A	AT^↓CGAT TAGC↑TA	CCC^↓GGG GGG↑CCC	GGTAC^↓C C↑CATGG

请结合图像，运用所学知识回答问题：

（1）含有PVY-CP的质粒pBBZY保存在某细菌群体中，各个细菌含有相关不同的基因，这样的细菌群体称为_____________. 

（2）以下对于步骤②中Klenow Polymerase这种物质功能方面的猜测，合理的是______（多选）。

A.具有催化作用         

B.可以将DNA片段的黏性末端变成平末端

C.可以被胰蛋白酶水解   

D.与DNA连接酶的功能相似

(3)步骤④中应该使用的限制酶是_______________（注意基因接入的方向）。

（4）以上过程中构建的基因表达载体除了图中所显示的组成部分以外，还应该包括______________________和复制原点等组成部分。

（5）利用农杆菌对植物体细胞进行转化，操作过程如下：首先需要将重组质粒pEY3导入____________________细胞中，要实现重组质粒成功导入，应使其处于____________。而后将转化的细胞转移到含有______________的培养基上进行筛选，再用于侵染植物细胞，最后将转化成功的植物细胞过_____________________技术培养成转基因抗病毒马铃薯植株。

Answer

基因文库 ABC BglⅡ、SmaⅠ 终止子 农杆菌 感受态 卡那霉素 植物组织培养

【解析】【试题分析】

本题结合图表，考查基因工程、植物组织培养的相关知识，要求考生识记基因工程的工具及操作步骤，能分析流程图，从中获取有效信息准确判断第（2）题；能分析表格，明确BglⅡ和BamHI切割后形成的黏性末端相同；识记植物组织培养技术的过程及应用。分析题图：图示是获得抗病毒马铃薯的部分操作，步骤①～③是从质粒A中获取目的基因（PVY-CP）的过程；质粒pMON316是选用的运载体，④过程需要用限制酶处理质粒pMON316；⑤表示基因表达载体的构建过程，该过程需要DNA连接酶。

（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，这样的细菌群体称为基因文库。

（2）据图可知，质粒pBBZY经步骤①用限制酶HindⅢ切割后得到2个黏性末端，而经步骤②Klenow Polymerase这种物质的作用后，将DNA片段的黏性末端补齐变成了平末端，由此可推知Klenow Polymerase这种物质具有催化作用，是一种酶，与DNA聚合酶的功能相似，故A、B项正确，D项错误；该酶的化学本质是蛋白质，可被胰蛋白酶水解，C项正确。

（3）据图可知，由步骤③获取的目的基因一端平齐，一端为黏性末端，故步骤④中需选择一种黏性末端相同的限制酶，另一种选择平末端限制酶（SmaⅠ）。根据质粒pMON316上相关限制酶的识别序列和切割位点，再考虑目的基因接入的方向，不能用BamHⅠ切割质粒pMON316。根据表格中部分限制酶识别序列和切割位点可知，BamHⅠ和BglⅡ两种限制酶切割形成的黏性末端相同，而且BglⅡ的识别序列恰好位于SmaⅠ酶识别序列的上方，符合目的基因的接入方向，所以步骤④中应该使用的限制酶是BglⅡ、SmaⅠ。

（4）图中已经显示了该基因表达载体的组成部分有启动子、目的基因和标记基因（NPTⅡ基因），此外，作为基因表达载体，其组成部分还应该包括终止子和复制原点等。

（5）利用农杆菌转化法进行转化，首先需要将重组质粒pEY3导入农杆菌细胞中，进而转化马铃薯细胞；要实现重组质粒成功导入农杆菌，应使其处于感受态；由于基因表达载体上含有的标记基因是卡那霉素抗性基因（NPTⅡ基因），所以转化后的农杆菌细胞需先转移到含有卡那霉素的培养基上进行筛选，再用于侵染植物细胞，最后将转化成功的植物细胞过植物组织培养技术培养成转基因抗病毒马铃薯植株。