Question

某质粒上有SaiⅠ、HindⅢ、 BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四坏素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。回答下列问题：

（1）将目的基因导入植物细胞，釆用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是__________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为__________。该方法从农杆菌的作用是__________。

（2）在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SaiⅠ两种酶的好处是____________________。

（3）含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否巳含有目的基因? __________（填“是”或“否”）。为什么？__________。

（4）将已经转化的农杆菌进行如下筛选，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B（含氨苄青霉素）和C（含四环素和氨苄青霉素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如下图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中?请在图中相应的位置上圈出来。

Answer

Ti质粒 T-DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 防止目的基因自连和质粒自连,以形成带有目的基因的重组质粒 否 含有目的基因的质粒中抗四环素的基因被破坏

【解析】试题分析：农杆菌转化法主要操作步骤是将含目的基因的重组质粒首先导入土壤农杆菌中，再通过土壤农杆菌侵染植物细胞，使植物细胞获得重组质粒，利用质粒中含有的T-DNA片段将目的基因插入到植物细胞的染色体DNA上整合，最后进行选择培养、筛选获得转基因植株。

（1）结合前面的分析，根据农杆菌转化法的原理，该方法中应用的质粒必须是具有可转移的T-DNA的Ti质粒。该方法中农杆菌的作用是感染烟草细胞，进而把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上。

（2）在构建重组质粒时，如果只用一种酶切割目的基因的两端及质粒，切割后的目的基因或者质粒各自出现的两个黏性末端碱基序列正好能互补配对，容易发生目的基因或质粒各自自连的现象，但是如果选用HindⅢ和SalⅠ两种酶切割目的基因或质粒，则可以避免这种自连现象的发生，这样将切割后的它们混合，在DNA连接酶的作用下，才可以得到更多的目的基因和质粒相连接的重组质粒。

（3）根据图示分析，所给的限制酶在质粒上的切割位点都位于抗四环素基因的部位，如果目的基因插入到质粒中，得到重组质粒，则含重组质粒的农杆菌只含有完整的抗氨苄青霉素基因，不含完整的抗四环素基因（被目的基因破坏），而这种农杆菌不能在同时含两种抗生素的培养基中正常生长繁殖，只能在含抗氨苄青霉素的培养基中生长繁殖。

（4）结合图示操作分析，由于B、C两个培养基中相同位置接种的来自A中的菌种是都能抗氨苄青霉素的，在B、C中培养对比分析，由C中培养的有两个位置的菌落消失，说明这两个位置的菌种只能抗氨苄青霉素，不能同时抗两种抗生素，所以推测这两个位置的菌种是含有重组质粒的农杆菌（见参考答案的两圆圈处）。