Question

华蟾素注射液是将蟾蜍的全皮阴干后，提炼而成的中药复方制剂，是我国经典抗肿瘤药物。研究人员为探寻华蟾素注射液抗肝癌HepG-2细胞的作用机理，进行了一系列实验。请根据题中信息回答下列问题。

Ⅰ.肝癌HepG-2细胞的培养：

（1）培养肝癌HepG-2细胞时，在培养基中加入适量的__________以补充合成培养基中缺乏的物质，为防止培养过程发生污染要加入______。此外，每48h更换1次培养液，目的是__________。同时还要提供适宜的温度、______、氧气和二氧化碳等环境条件。

Ⅱ.探究华蟾素药效作用机理的实验：

（2）用不同浓度的华蟾素注射液分别处理HepG-2细胞12h、24h和48h，测定华蟾素注射液对HepG-2细胞增殖的影响，结果如下图。

由图甲可知，华蟾素能有效地______肝癌HepG-2细胞增殖，且与______呈正相关。图乙的结果进一步表明，华蟾素对肝癌HepG-2细胞增殖的影响体现在______________。

（3）DNA拓扑异构酶Ⅱ（简称TopoⅡ）为真核生物所必需，在DNA复制、转录、重组及形成正确的染色体结构、染色体分离、浓缩等方面发挥重要作用，TopoⅡ在肿瘤细胞中含量明显高于正常细胞。华蟾素注射液处理HepG-2细胞48h后，采用RT-PCR技术检测TopoⅡ基因的表达情况，结果如图丙。

①RT-PCR即逆转录-聚合酶链反应。其主要原理是：提取HepG-2细胞中的总RNA， 以一段_______作为引物，在________酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板进行_________。

②由图丙可知，华蟾素注射液在基因水平上影响肝癌HepG-2细胞的机理是______。

Answer

血清（血浆） 抗生素 防止代谢物积累对细胞自身造成危害（补充细胞所需营养物质） pH 抑制 作用时间和浓度 将癌细胞阻滞在S期 与TopoⅡmRNA互补的单链DNA 逆转录 PCR扩增 抑制TopoⅡ基因的转录/表达，最终导致TopoⅡ含量降低

【解析】【试题分析】

1．在动物细胞培养时，所需营养物质有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。将这些营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。

2．逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

（1）在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量动物血清，以补充合成培养基中缺乏的物质；为防止培养过程发生污染要加入一定量的抗生素；定期更换培养液的目的是清除代谢产物，防止代谢物积累对细胞自身造成危害（补充细胞所需营养物质）；同时还要提供适宜的温度、pH、氧气和二氧化碳等环境条件。

（2）分析图甲可知，随着华蟾素注射液浓度的增加和作用时间的延长，对HepG-2细胞的抑制率增大，说明华蟾素能有效地抑制肝癌HepG-2细胞增殖，且与作用时间和浓度呈正相关；由图乙可知，随着华蟾素注射液浓度的增加，肝癌HepG-2细胞S期细胞细胞比例增大，表明华蟾素对肝癌HepG-2细胞增殖的影响体现在将癌细胞阻滞在S期。

（3）①RT-PCR主要原理是：提取HepG-2细胞中的总RNA， 以一段与TopoⅡmRNA互补的单链DNA作为引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。

由图丙可知，华蟾素注射液在基因水平上影响肝癌HepG-2细胞的机理是抑制TopoⅡ基因的转录/表达，最终导致TopoⅡ含量降低。