Question

已知图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，且限制酶的切点是唯一的，外源DNA插入会导致相应的基因失活。请回答有关基因工程操作的问题：

    (1)图1表示的是一个经过____的作为载体的质粒。作为基因表达载体除图1所示结构外，还需具有____。

    (2)根据图中所给信息，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是____。若将基因表达载体导人大肠杆菌，一般先用钙离子处理，使其成为感受态细胞，以利于____，然后调控温度完成转化过程。

    (3)为了筛选出含目的基因的大肠杆菌，应在培养基中添加____；培养一段时间后，平板上长出菌落。用PCR技术鉴定时，所用的引物是图2中____。PCR技术扩增目的基因，每一循环包括变性、____、____三步。

Answer

人工改造 目的基因和终止子 BclI和HindⅢ 吸收周围环境中的DNA分子 四环素 引物甲和引物丙 复性（退火） 延伸

【解析】试题分析：基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）图1表示的是一个经过人工改造的作为载体的质粒；基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等。

（2）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，因此只能选BclI和HindⅢ两种限制酶切割。将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即用Ca2+处理，使其处于感受态，以利于吸收周围环境中的DNA分子；然后让基因表达载体在缓冲液中与该细胞混合，调控温度完成转化过程。

（3）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，根据质粒上的抗性基因，应在筛选平板培养基中添加四环素。PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙。PCR技术扩增目的基因，每一循环包括变性、复性（退火）、延伸三步。

【点睛】解答本题的关键是分析质粒和目的基因两侧的限制酶切割位点，从而确定使用的限制酶种类。