Question

如图是含某目的基因的DNA片段，据图回答下列问题：

（1）若用EcoRⅠ限制酶获取其中的目的基因，其识别核苷酸序列及切割位点是___________。该DNA片段经切割后共形成_______个_____________（填“平”或“黏性”）末端。

（2）若图示DNA片段中EcoRⅠ限制酶识别序列的一个碱基突然改变，则可能发生的情况是_______________________________________。

（3）使用________________连接目的基因和载体，连接的是图中________(填字母)部位的___________________（化学键）。

（4）为了避免目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，需用两种限制酶XbaI和SacI(两种酶切出的粘性末端不同)同时切割含目的基因的DNA片段和质粒。若用Ti质粒作为目的基因的载体，应选用下图中何种Ti质粒？ _______________

Answer

—G↓AATTC— 4 黏性 此DNA片段中无EcoRⅠ限制酶的识别序列 DNA连接酶 X 磷酸二酯键 甲

【解析】本题考查基因工程的知识，主要考查基因工程的基本操作程序，要求考生能识记基本操作的四个步骤，理解每个步骤的操作要点、使用工具及要达到的目的，同时能利用所学知识分析图形，进行正确的分析判断。

（1）限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；不同限制酶识别的核苷酸序列和切割位点有差异，来自大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶识别的核苷酸序列及切割位点是—G↓AATTC—，由于题图的DNA片段含有两处EcoRⅠ限制酶的识别序列（分别位于目的基因的左右两侧），因此可用EcoRⅠ限制酶从图中DNA获取其中的目的基因，该DNA片段经切割后共形成4个黏性末端。

（2）限制酶识别的核苷酸序列具有特异性，若图示DNA片段中EcoRⅠ限制酶识别序列的一个碱基突然改变，突变后的序列与突变前的序列不同，则此DNA片段中无EcoRⅠ限制酶的识别序列。

（3）图中X处是不同核苷酸之间的磷酸二酯键，Y处是碱基对之间的氢键，Z处是核苷酸分子内部碱基与脱氧核糖之间的化学键，基因工程中使用DNA连接酶连接目的基因和载体，连接的是图中X部位的磷酸二酯键。

（4）为了避免目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，需用两种限制酶XbaI和SacI(两种酶切出的粘性末端不同)同时切割含目的基因的DNA片段和质粒。若用Ti质粒作为目的基因的载体，则还要保证将目的基因插入T-DNA区段内部，才能实现T-DND携带目的基因整合到受体细胞染色体的DNA中，因此根据图中T-DNA位置及对应的两种限制酶，只有甲图才符合要求。

【点睛】方法技巧——正确判断限制酶的选择：

基因工程中限制酶的选择一直是学生理解的难点和答题时的易错点，现分析整理如下：

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类：

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。