Question

下图1为某种常用质粒的序列图，Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Amp^r为氨卡青霉素抗性基因。图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列。请回答下列问题：

（1）若要筛选成功导入目的的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有_____和_______，构建重组质粒时需要的工具酶有_____。

（2）采用PCR技术扩增目的基因所依据的原理是________。

（3）实验小组用BamH Ⅰ和Bal Ⅱ两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中。在筛选重组质 粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入________；若大肠杆菌落显白色，说明导入了________。没有导入任何外源DNA的大肠杆菌_______（填“能”或“不能”）在该培养基上生存。

（4）将若干个质粒和目的基因用BamH Ⅰ和Bal Ⅱ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，然后再用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb 四种长度的DNA片段，则目的基因的长度为____kb。 （已知目的基因的长度大于1kb，1kb=1000 个碱基对）

Answer

X—gal 氨卡青霉素 限制酶 DNA连接酶 DNA双链复制 没有目的基因的空质粒 重组质粒 1.8

【解析】试题分析：分析图1，质粒中有两个标记基因（Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Ampr为氨卡青霉素抗性基因），2种限制酶（BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ）的切割位点共3个，其中BamH Ⅰ有2个切割位点且都位于标记基因——Lac Z基因之中，EcoR Ⅰ只有1个切割位点。分析图2，目的基因的两端各有1个限制酶酶切位点，分别是BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ，所以要想获得目的基因，必须同时用这两种限制酶进行切割，同时给出了这两种限制酶的识别序列和准确的切割位点，比较发现，两种限制酶切开后露出的粘性末端的碱基序列相同。

（1）若要筛选成功导入目的的基因的重组质粒，培养基中应加入两种标记基因有关的物质有，即X—gal 和氨卡青霉素，这样才能借助标记基因的作用有目的的筛选出含目的基因的受体细胞。由于构建重组质粒时需要用限制酶切割质粒同时在将目的基因与切开的质粒连接后，还需要DNA连接酶才能让二者连接，所以需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶。

（2）PCR技术扩增目的基因所依据的是DNA双链复制原理。

（3）为了让切割后的目的基因插入到切开的质粒中，目的基因必须插入到质粒的Lac Z基因之中，这样会导致重组质粒中Lac Z基因被破坏。若破坏了Lac Z基因的重组质粒导入到大肠杆菌后，在加有X—gal物质的大肠杆菌培养基中，则无法显示蓝色；反之，显示了蓝色的说明导入大肠杆菌的不是插有目的基因的质粒，而是空质粒；若大肠杆菌内没有导入质粒，这样的大肠杆菌会逐渐被淘汰。

（4）根据题意：用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb 四种长度的DNA片段，说明得到了两种连接产物，一种被切割为2.8kb和0.7kb两段；一种被切割为2.5kb和1.0kb两段；进而得到重组质粒总长度为2.8+0.7=2.5+1=3.5kb，分两种情况进行分析如下图甲、乙所示：

（说明：图中箭头位置表示酶切位点，AB表示插入的目的基因的两端）

图甲 图乙

甲图计算得出目的基因的长度为1.8kb，乙图计算得出目的基因的长度为0.3kb。由于题目给出目的基因的长度大于1kb，所以最终得出目的基因的长度为1.8kb。

【点睛】本题的难点在于最后一个小题，必需读懂题意“两种限制酶切出四段DNA片段”代表得到了两种连接产物，一种被切割为2.8kb和0.7kb两段；一种被切割为2.5kb和1.0kb两段；进而得到重组质粒总长度为2.8+0.7=2.5+1=3.5kb；同时还必需考虑到目的基因如果较长和较短两种情况（如图所示），才能顺利分析出符合题目要求的答案。