Question

(一)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程。

(1)在步骤①中，用_______稀释制成不同浓度的样品悬液。

(2)步骤②中将保存在70%酒精中的___________放在酒精灯火焰上，待火焰熄灭，将菌液涂布到整个

平面，将培养皿___________在37°C恒温培养箱中培养24〜48小时，观察菌落数。

(3)步骤③应选择挑取涂布平板上长出的__________，再通过划线进一步_______________。

(4)步骤④中，将菌种接种在_____________培养基中，在37°C恒温培养箱中培养24h后，置于_______冰箱中保存。

(5)若该漆酶大量应用于环境修复，可先用石英砂对漆酶进行_________(A.包埋B.共价偶联C.吸附D.交联)法固定，再进行工业化使用。

(二)经研究表明，在多种肿瘤细胞中的TOP2A蛋白大量表达，因此成为抗肿瘤的研究靶点，某科研单位制作了TOP2A蛋白的单克隆抗体。请回答：

(1)利用基因工程制备TOP2A蛋白：将TOP2A蛋白基因和质粒用___________处理并连接成重组质粒，然后导入经_________处理的大肠杆菌，并将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，经离心得到菌体，破碎提纯得到TOP2A蛋白。

(2)TOP2A蛋白单克隆抗体的制备:将TOP2A蛋白反复多次注射到小鼠体内，使其发生_________，取经过免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞在物质_________介导下发生细胞融合，形成杂交瘤细胞。并将各杂交瘤细胞单独分装培养，经筛选、___________后，获得能产生单一抗体的__________(A.连续细胞系B.有限细胞系C.连续细胞株D.有限细胞株）。

Answer

无菌水 玻璃刮刀 倒置 单菌落 纯化 斜面 4°C C DNA连接酶和限制性核酸内切酶 CaCl2 免疫反应 聚乙二醇 克隆培养 C

【解析】本题考查微生物分离计数及单克隆抗体技术等相关知识，微生物培养的关键是防治杂菌污染，微生物接种的常用方法有平板划线法和稀释涂布平板法，结合图中的“涂布”可判断出本题使用的是稀释涂布平板法；相对于细胞来说，酶分子更小，更适合于使用吸附法固定；单克隆抗体制备过程中，需对融合后的细胞进行培养并进行两次筛选，才能得到分泌特定抗体的杂交瘤细胞。

(一) (1)结合题意分析过程图可知，步骤①是制取样品悬液，要用无菌水稀释制成不同浓度的样品悬液，以避免混入其它杂菌。

(2)步骤②是涂布过程，应将保存在70%酒精中的玻璃刮刀（涂布器）放在酒精灯火焰上，待火焰熄灭，将菌液涂布到整个平面，然后将培养皿倒置在37°C恒温培养箱中培养24〜48小时，观察菌落数。

(3)步骤③应选择挑取涂布平板上长出的单菌落，再通过划线进一步纯化。

(4)步骤④中，将菌种接种在斜面培养基中，在37°C恒温培养箱中培养24h后，置于4°C冰箱中低温保存菌种。

(5)酶分子较细胞小，一般使用吸附法固定，若该漆酶大量应用于环境修复，可先用石英砂对漆酶进行吸附法固定，再进行工业化使用。

(二) (1)基因工程中，构建重组质粒时需使用DNA连接酶和限制性核酸内切酶处理，将目的基因（TOP2A蛋白基因）与质粒相连形成重组质粒；将目的基因导入大肠杆菌的方法是用CaCl2处理，使大肠杆菌细胞处于感受态，从而目的基因导入大肠杆菌；将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，经离心得到菌体，破碎提纯得到TOP2A蛋白。

(2) 制备TOP2A蛋白单克隆抗体时，先将TOP2A蛋白反复多次注射到小鼠体内，使其发生免疫反应；再取经过免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞在聚乙二醇介导下发生细胞融合，形成杂交瘤细胞；然后将各杂交瘤细胞单独分装培养，经筛选、克隆培养后，即可获得能产生单一抗体的连续细胞株。