Question

目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________。

（2）pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—G^↓AATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

（3）pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复________键，成功地获得了重组质粒。说明____________。

（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是____________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________________。

Answer

（每空2分，共12分）（1）筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）

（2）

（3）磷酸二酯 两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同

（4）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322 质粒

【解析】（1）质粒上的抗性基因可作为标记基因，以便于筛选和鉴别目的基因是否导入受体细胞。

（2）目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，即目的基因的两侧各有—G↓AATTC—，因此目的基因的两侧被酶EcoRⅠ切割后形成的黏性末端为。

（3）DNA连接酶能连接磷酸二酯键，经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因能够连接起来，成功地获得重组质粒，这说明两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同。

（4）将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落，说明图二中的菌落能抗氨苄青霉素。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，仍能生长的也能抗四环素，空圈表示在含四环素的培养基上不能生长的，说明不能抗四环素（只能抗氨苄青霉素）。综上分析，与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。图三结果显示，多数大肠杆菌既能抗氨苄青霉素，也能抗四环素，说明导入的是pBR322 质粒，而不是重组质粒（重组质粒的四环素抗性基因被切断，不能表达，因此含重组质粒的大肠杆菌抗氨苄青霉素）。

【考点定位】基因工程