Question

转基因生物可用于生产人类所需要的药用蛋白，如激素、抗体、疫苗、酶等。下图甲是通过生物工程培育能产生人胰岛素的烟草的过程。请据图回答下列问题：

（1）基因工程的核心步骤是________（填字母）。此过程所需的工具酶是______________。

（2）下图乙是载体和反转录得到的胰岛素基因的片段，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。Gene Ⅰ和Gene Ⅱ为质粒上的标记基因，根据图示分析，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割目的基因。构建的重组质粒中，除含有外源基因、标记基因外，还必须含有________和________。

（3）B过程中，常用________处理使细菌成为感受态细胞，从而利于重组质粒的导入。

（4）如果从分子水平检测人胰岛素基因是否表达成功，可以采用______________方法。

Answer

（1）A 限制酶和DNA连接酶

（2）Ⅰ Ⅱ 启动子 终止子

（3）Ca2＋

（4）抗原—抗体杂交

【解析】（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即A过程，该过程首先需要限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，还需用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA分子。

（2）用限制酶Ⅱ切割质粒时会将两个标记基因都破坏，因此只能选用限制酶Ⅰ切割质粒，而切割含有目的基因的外源DNA分子时，只需用限制酶Ⅱ即可．构建的重组质粒中，除含有外源基因、标记基因外，还必须含有启动子和终止子。

（3）将目的基因导入微生物细胞时，常用感受态细胞法，即常用Ca2+处理使细菌成为感受态细胞，从而利于重组质粒的导入。

（4）从分子水平上检测目的基因是否表达成功，可以采用抗原-抗体杂交方法。

【考点定位】基因工程的原理及技术

【名师点睛】基因工程的基本工具：

1、“分子手术刀”--限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

2、“分子缝合针”--DNA连接酶

（1）两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：E•coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低．

（2）与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键．DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3、“分子运输车”--载体

（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

（2）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。